考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质
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发布时间：2022-04-19 19:56
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时间：2023-10-25 17:19
可溶性蛋白质含量的测定——考马斯亮蓝法一、原理考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。二、材料、主要仪器和试剂1、实验材料：植物叶片。2、主要仪器（1）分析天平、台式天平；（2）刻度吸管；（3）具塞试管、试管架；（4）研钵；（5）离心机、离心管；（6）烧杯、量筒；（7）微量取样器；（8）分光光度计。3、试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液。（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置1个月。（3）乙醇；（4）磷酸（85％）。四、操作步骤1、标准曲线制作（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。表1 低浓度标准曲线制作管号 1 2 3 4 5 61000μg／mL标准蛋白液（mL） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10蒸馏水（mL） 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100OD595nm （2）0~1000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1000μg／mL的标准曲线。表2 高浓度标准曲线制作管号 7 8 9 10 11 121000μg／mL标准蛋白液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水（mL） 1.00 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5蛋白质含量（μg） 0 200 400 600 800 1000OD595nm 2、样品提取液中蛋白质浓度的测定（1）待测样品制备：称取样品2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1号试管做空白。表3 待测液蛋白质浓度测定管号 13 14蛋白质待测样品提取液（mL） 0.1 0.1蒸馏水（mL） 0.9 0.9考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5OD595nm 蛋白质含量（μg） 五、结果计算样品蛋白质含量（mg∕g鲜重）=(C×V/a)/W式中：C为查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V为提取液总体积（ml）；A为测定所取提取液体积（ml）；W为取样量（g）。
