核酸序列的BLAST到底该怎么做?
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发布时间：2024-09-09 15:56
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在科学研究中，BLAST是一项常用的工具，用于在基因或蛋白质数据库中查找序列相似性。全称为Basic Local Alignment Search Tool，其结果通常以统计评分的形式呈现，以评估设计的引物特异性，这对于PCR实验的成功至关重要。
要进行核酸序列的BLAST，首先访问官方网址：blast.ncbi.nlm.nih.gov/...，并选择Nucleotide BLAST。在开始操作时，输入引物序列，可以选择同时输入上下游引物或单独输入。以Col1a1引物为例，输入序列5'-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3'和5'-ATTGGGGACCCTTAGGCCAT-3'，并根据目标物种选择合适的数据库。
在搜索设置中，选择Somewhat similar sequences (blastn)，并进行参数调整。一般建议将Expect threshold设为1000或更高，Word size设为7。完成设置后，点击BLAST，等待结果。BLAST结果显示包括E值、Total Score、Identities和Gaps等指标。E值反映匹配的不相关性，Total Score越高，特异性越好。通过解读这些评分，可以判断引物的有效性和特异性。
E值和Total Score通常在Description栏查看，低E值和高Total Score意味着更好的匹配。此外，图形总结部分显示了高特异性序列，颜色和连线可以帮助理解引物与目标基因的匹配情况。Identities表示匹配比例，Gaps则显示插入或缺失的碱基数，这两个指标对于引物质量至关重要。
在BLAST结束后，要确保选择的序列是目标基因，并结合所有评分指标综合判断引物的优劣。记住，尽管评分高，颜色一致并不总是最优，还需结合其他因素分析。
