搞定qPCR数据分析
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发布时间：2024-10-05 21:05
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时间：2024-10-05 21:10
qPCR实验的成功与否，关键在于数据是否符合判定标准及预期。掌握数据分析的关键，是确保结果可信度的第一步。主要通过Cq值计算进行，需要关注实验中的几个关键参数。
扩增曲线描绘了荧光信号量与循环数之间的关系，直观展示扩增过程。标准的扩增曲线呈现“S”型，包括背景信号、指数增长、线性增长和平台期四个阶段。基线为3-15个循环中荧光信号稳定的部分，需针对不同基因单独设定。阈值是荧光强度值，自动或手动设定，用于区分指数扩增阶段。
Cq值表示扩增产物达到设定阈值所需的循环数，与起始浓度呈线性关系。定量分析时，Cq值范围一般为15-35，过小或过大可能导致不准确。同时，分析扩增效率及相关系数也非常重要。扩增效率在90-110%之间为理想状态，R²值大于0.98表明数据相关性很好。
重复性反映了实验结果的一致性，通过标准偏差衡量。在PCR反应效率为100%时，2倍稀释点间的平均Cq间隔应为1个Cq值，标准偏差需在特定范围内，以确保实验的可靠性。
重现性则关注不同批次或实验室间的结果差异，通常通过拷贝数或Cq值的SD或CV表示。使用标准偏差计算，可评估不同实验间的稳定性和一致性。
灵敏度是指实验能检测的最小拷贝数，临床灵敏度为特定疾病患者阳性检测的百分比。通过梯度稀释样品可确定LOD，理论上最小为3拷贝。假设符合泊松分布，PCR有95%的可能性检测到至少1个拷贝。
准确度则是测量值与真实值的接近程度，通过倍数变化或拷贝数估算。特异性则是确保实验仅检测目的基因，避免非目标序列的扩增。通过凝胶电泳检测扩增产物的单一性，或溶解曲线判断单峰来确认特异性。
