分类号 U D C
密级 编号
硕士学位论文
丙丁酚对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF表达的影响
研究生姓名： 李 梅 指导教师姓名、职称： 学科、专业名称： 研
2011年5月
究
方
向
：
彭辉灿 教授 眼科学 眼底病
南华大学学位论文原创性声明
本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
作者签名： 年 月 日
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作者签名： 导师签名：
年 月 日 年 月 日
目 录
主要英文缩写词索引 ................................................................................................... 1 中文摘要 .......................................................................................................................... 2 英文摘要 .......................................................................................................................... 4 论文正文
前 言 ..................................................................................................................... 6 实验材料 ..................................................................................................................... 8 实验方法 ................................................................................................................... 10 实验结果 ................................................................................................................... 15 讨 论 ................................................................................................................... 21 结 论 ................................................................................................................... 27 参考文献 ................................................................................................................... 28 综 述 ........................................................................................................................ 32 发表文章 ........................................................................................................................ 44 致 谢 .......................................................................................................................... 45
主要英文缩写词索引
英文缩写 DR RNV VEGF HRCEC
PBC DMSO A PBS DMEM DAB MTT
FCS
英文全称 diabetic retinopathy retinal neovascularization vascular endothelial growth factor human retinal capillary endothelial cell
probucal
dimethyl sulphoxide absorbance
phosophate-buffered saline
dulbecco minimum essential medium diaminobezime
3-（4，5-dimethylthiazol—2）2，5-diphenyl tetrazolium bromide
fetal culf serum 1
中文名称 糖尿病视网膜病变 视网膜新生血管 血管内皮生长因子 人视网膜血管内皮细胞
普罗布考 二甲基亚砜 光吸收值 磷酸缓冲盐溶液 Dulbecc极限必需培养基二氨基联苯胺
噻唑蓝 胎牛血清
丙丁酚对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF
表达的影响
硕士研究生：李梅 导 师：彭辉灿教授
中 文 摘 要
目的 研究不同浓度的丙丁酚(普罗布考 probucol)对体外培养的高糖环境下人视
网膜微血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells, HRCECs)增殖及血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响，为糖尿病视网膜病变药物防治提供新的思路和理论依据。
方法 体外培养从角膜移植术后获得的新鲜人眼球提取的HRCECs。取生长良好的第
3 ～4 代细胞用于实验,实验分为调零组、低糖对照组、高糖对照组、高糖+(5µmol/L、10µmol/L、20µmol/L、40 µmol /L、80µmol/L )不同浓度丙丁酚组,用噻唑蓝比色法(MTT)检测24h不同质量浓度的丙丁酚对高糖环境下HRCECs增殖的抑制作用，用免疫细胞化学法检测高糖下HRCECs中VEGF的表达。
结果 1、MTT比色法结果显示：低糖、高糖对照组及高糖+不同浓度的丙丁酚
(5µmol/L、10µmol/L、20µmol/L、40µmol/L、80µmol/L )加药组作用于原代培养的HRCECs24h，吸光度A值分别为0.8172±0.0116，0.9317±0.0123，0.8628±0.0111，0.7608±0.0103，0.6455±0.0221，0.5600±0.0109，0.4775±0.0106，加药组细胞增生抑制率分别为8.40%
20.84%34.90%45.32%55.38%。一定质量浓度范围内
丙丁酚可抑制高糖环境下HRCECs的增殖（P<0.05）,且随着药物浓度的提高，细胞抑制率逐渐提高。高糖对照组吸光度A值明显高于低糖对照组，两者相比差异有明显统计学意义（P<0.05）。2、低糖、高糖对照组及高糖+不同浓度的丙丁酚（5µmol/L、40µmol/L、80µmol/L）加药组作用于HRCECs24h，免疫细胞化学检测HRCECs中VEGF的表达，其背景灰度值与阳性灰度值之差分别为28.75±3.77、71.93±8.37、54.67 ±4.33、41.43± 3.45、29.18±3.37。与高糖对照组相比，加药组作用HRCECs24h VEGF表达明显下降（P<0.05），且随着药物浓度的提高，VEGF的表达量逐渐减少。与低糖对照组相比，高糖对照组VEGF的表达明显增加（P<0.05）。
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结论 1、丙丁酚能抑制体外培养的高糖环境下HRCECs的增殖，呈浓度依赖性；2、
丙丁酚能下调体外培养的高糖环境下HRCECs中VEGF的表达，呈浓度依赖性；3、丙丁酚抑制体外培养的高糖环境下HRCECs的增殖可能是通过下调其VEGF表达而发挥作用。
关键词 丙丁酚；人视网膜微血管内皮细胞；增殖；血管内皮生长因子
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Effects of probucol on proliferation and expression of VEGF of human retinal capillary endothelial cells in
high glucose environment
Abstract
Ｏbjective To investigate the effects of probucol（PBC）with different concentrations
on the proliferation and expression of intercellular vascular epithelial growth factor（VEGF）of human retinal capillary endothelial cell in high glucose environment cultured In vitro and to provide a new clue and theory basis for developing a drug of preventing and curing retinal neovascularization in the future.
Methods HRCECs were extracted from fresher eyeball after corneal transplantation
and cultured in vitro, which being at the 3-4rd generation and good growth were taken in experiment. The experimental subjects were divided into low glucose control group, high glucose control group and high glucose +(5µmol/L、10µmol/L、20µmol/L、40 µmol /L、80µmol/L ) different concentrations PBC groups. The effect of PBC on the proliferation of HRCECs for 24 hours was measured by MTT assay.Immunocytochemistry process detected the effect of PBC on the expression of VEGF of HRCECs.
Results 1.We observed human retinal capillary endothelial cells throught MTT assay
indicated PBC at the concentrations of 5µmol/L、10µmol/L、20µmol/L、40 µmol /L、80µmol/L acted at HRCEC, the inhibition rates were 8.40%、20.84%、34.90%、45.32%、55.38% respectively. The A570 in low glucose control group, high glucose control group and high glucose +(5µmol/L、40µmol/L、80µmol/L ) different concentrations PBC groups are 0.8172±0.0116，0.9317±0.0123，0.8628±0.0111，0.7608±0.0103，0.6455±0.0221，0.5600±0.0109，0.4775±0.0106. There was significant reduced in different concentrations of probucol treating groups at 24 hours in comparison with high glucose control group (P<0.05). High glucose control group significantly higher than the low glucose control group（P<0.05）. 2. The expression of VEGF in low glucose control group, high glucose control group and high glucose +(5µmol/L、40µmol/L、80µmol/L ) different
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concentrations PBC groups are 28.75±3.77、71.93±8.37、54.67 ±4.33、41.43± 3.45、29.18±3.37. Compared with the high glucose control group, PBC decreased the intercellular expression of VEGF obviously (P<0.05). However, in high glucose group, the expression of VEGF was significantly higher than the low glucose control group (P<0.05).
Conclusion PBC can inhibit the expression of VEGF of HRCECs in high glucose
environment cultured In vitro, which maybe one of important mechanisms to inhibit the proliferation of HRCECs.
Keywords Probucol; human retinal capillary endothelial cells; proliferation;VEGF
Postgraduate: Li Mei (ophthalmology) Directed by: Professor Peng Hui-can
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前 言
糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种由多种原因引起糖代谢紊乱的内分泌疾病,目前世界范围内DM患者人数已超过2亿人，再过10年，将超过3亿人口[1]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病的晚期眼部严重的微血管并发症，晚期可致盲，患者产生不可逆性的失明。DR的发生、发展与患者血糖控制效果息息相关，患者血糖控制水平及其波动性直接决定着视网膜病变的发展。糖尿病患者出现眼部微血管病变一般病程已多达10年以上，定期的眼底视网膜检查是发现、控制视网膜病变和有效降低致盲率的重要手段。DR发病的中心环节是高血糖症及其引起的一系列病理生理改变，主要包括血—视网膜屏障的破坏，视网膜微动脉瘤的形成、血管渗漏、闭锁，组织缺血、缺氧、新生血管的形成，引起玻璃体出血和视网膜脱离，从而致盲。DR发病机制较复杂，主要包括以下几种假说：多元醇通路、糖基化终末产物的过量生成、血管生长因子、蛋白激酶C的激活、免疫炎症因素、遗传因素等，视网膜微血管的病变和视网膜神经细胞的病变是一个多因素相互协同的多途径、多阶段的综合过程。糖尿病视网膜病变是一种慢性病变，发展进程分三个阶段[2]：非增殖型糖尿病视网膜病变：出现视网膜微动脉瘤、硬性渗出及点片状出血；早期增殖型视网膜病变：出现软性渗出、大片状出血及静脉扩张、迂曲，呈“腊肠”样；晚期增殖型视网膜病变：可见视网膜新生血管、玻璃体积血、视网膜脱离。增殖型糖尿病视网膜病变（PDR）标志性的病理改变是大量视网膜新生血管的形成。PDR患者房水及玻璃体中VEGF、细胞因子、生长因子等促血管新生因子水平显著高于正常水平[3,4,5]，其中起着最关键作用的可能是VEGF[5]。当前如何更好的预防和治疗新生血管已成为眼科基础研究公认的热点和难点。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF), 是一种与血管增殖密切相关的多肽类生长因子，也可称为血管渗透性因子[6]，是新近发现的一种血管内皮细胞特异性刺激因子[7]，与诸多生理及病理过程有关。科学家在20世纪从脑垂体滤泡星状细胞体外培养液中分离纯化的VEGF，能与血管内皮相应受体结合促进内皮细胞的迁移及增生。为了维持血管及视网膜的稳定及发育的正常，正常人的血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞、周细胞和Müller细胞等都可产生少量的VEGF, 因此在人的肝、肾、脑、肺、眼、脾等组织中可检测到VEGF的存在。大量的VEGF可导致血管渗透性增加及新生血管的形成，而缺血缺氧是多种细胞分泌VEGF的主
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要刺激因素之一[8]，因此VEGF的大量产生被认为是缺血缺氧所致的视网膜新生血管形成的主要因素。缺血缺氧使视网膜产生大量的VEGF，其不断在玻璃体腔及网膜上积聚, 可能为视网膜新生血管形成做准备。
丙丁酚( Probucol ,普罗布考)，化学名：4 ,4-[ (1- 甲基亚乙基) 双(硫) ]双[2 ,6-双(1, 1-二甲基乙基) 苯酚]，由法国Sanofi-Aventis公司研发，1977年首次在美国上市。普罗布考(Probucol)，作为一种降脂药物应用于临床[9]，商品名之乐。是目前用于临床的抗氧化作用较强的人工合成抗氧化剂，最初以降脂药应用于临床，主要降低血清胆固醇。近年来随着对其药理作用研究的深入,发现其同时还具有抗炎、抗经皮冠状动脉介入(percuta neous coronary intervention,PCI)术后再狭窄及预防血栓的形成、改善内皮细胞功能、防治糖尿病及并发症、保护神经系统等作用。
本实验研究旨在将不同浓度的丙丁酚作用于高糖环境下HRCECs，动态观察细胞增殖抑制率，并通过免疫细胞化学法检测该细胞产生VEGF的量，从而研究新生血管发生机制，为预防及治疗糖尿病视网膜病变新生血管的形成提供新的思路及准备。
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实验材料
1、眼球
角膜移植手术后新鲜人眼球
2、药品与主要试剂
丙丁酚 DMEM培养基 胎牛血清（FCS） 二甲基亚砜（DMSO） 胰蛋白酶
二乙烯四乙酸二钠（EDTA） 噻唑蓝（MTT） 谷氨酰胺
兔抗人血管内皮生长因子IgG 兔抗人Ⅷ因子IgG DAB显色试剂盒
SABC法免疫细胞化学试剂盒3、主要仪器
普通离心机 倒置相差显微镜 CO2培养箱 恒温水浴箱 可调微量加样器
美国Sigma公司 AMRESCO公司 杭州四季青生物工程公司 AMRESCO公司 AMRESCO公司 美国Sigma公司 AMRESCO公司 AMRESCO公司
美国Proteintech Group公司 美国Proteintech Group公司 AMRESCO公司 AMRESCO公司
长沙维尔康湘鹰离心机有限公司重庆奥特光学仪器有限公司 SANYO公司
苏州威尔实验用品有限公司 芬兰Biolife公司
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pH计
低温高速离心机 Tip头
55mm孔径不锈钢筛网 110mm孔径不锈钢筛网 75cm2细胞培养瓶 25cm2细胞培养瓶 96孔细胞培养板 6孔细胞培养板 超净工作台 自动酶标读数仪 手术显微镜 电子天平
图像分析系统（免疫细胞化学结果分析）
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上海精密仪器仪表有限公司 上海精密仪器仪表有限公司 AMRESCO公司 浙江永康市亿利达仪筛厂 浙江永康市亿利达仪筛厂 AMRESCO公司 AMRESCO公司 AMRESCO公司 AMRESCO公司
吴江市华通净化技术有限公司美国Bio-Rad 日本TOPCON610型 上海精密仪器仪表有限公司 北京华威中仪科技有限公司
实验方法
1、主要试剂的配制
1.1 培养液的配制
将小包DMEM干粉及3.7g NaHCO3溶解到800ml三蒸去离子水中，充分搅拌混匀后加三蒸水至1000ml，用PH计将PH值调至7.3后，用微孔滤膜（0.22μm）滤器过滤除菌，在无菌条件下分别装入250ml盐水瓶，置于-20℃冰箱内保存，用时融解后置于4℃冰箱内保存。
将胎牛血清置于56℃水浴箱内灭活，不断摇晃30分钟，灭活后将其分装，置于-20℃保存。在超净工作台内用一次性0.9Nacl%溶液将无菌青霉素、链霉素粉剂溶解、分装后，将其置于-20℃保存。用时可将胎牛血清及双抗加入DMEM液，配制成含10%胎牛血清及青霉素100μ/mL、链霉素100g/ml双抗的培养基。
1.2 PBS缓冲液的配制
用电子天平称取KCL 0.20g，KH2PO40.24g，NaH2PO（3.62g， NaCL8.0g，412H2o）将其充分溶解于800ml三蒸水中，搅拌均匀，加入适量5%NaOH调节PH值为7.3左右，加三蒸水至1000ml，分装到250ml盐水瓶后，置于高压灭菌锅炉内经121℃，灭菌30min，置于4℃冰箱保存。
1.3 胰蛋白酶的配制
电子天平称取0.25g的胰蛋白酶粉剂，将其充分均匀溶于100mlPBS中，调节PH值至 7.3左右，置于4℃冰箱内过夜，在超净工作台内用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌，无菌操作下分装后，置于4℃冰箱保存。
1.4 MTT溶液的配制
避光环境下用电子天平称取50mg MTT，将其溶解于100mlPBS中，不断搅拌使其均匀溶解后，超净工作台内用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，分装到EP管中，置于铝盒内，避光保存于-20℃冰箱，用时取出融解，避免反复冻融。
1.5 冻存溶液的配制
在超净工作台内将7ml培养基、2ml胎牛血清、1ml甘油加入到10ml离心管中混匀，置于4℃冰箱保存，一般现用现配。
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1.6 丙丁酚溶液的配制
丙丁酚，来自美国Sigma公司，药品为白色或类白色的结晶性粉末，有特臭，纯度98%，分子量：517.86，分子式：C31H48O2S2 ，干燥室温条件下保存，使用二甲基亚砜(DMSO)助溶稀释为125mg/ml，微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，置4℃冰箱保存。
1.7 PBST缓冲液的配制
取300μl Tween-20 加入100ml PBS液中，混匀后调节PH值为7.3左右，微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌后，尽快使用现用现配。
2、细胞培养及鉴定
2.1 人视网膜微血管内皮细胞的原代培养
从眼科手术室获取角膜移植术后的新鲜人眼球。用组织剪在显微镜下无菌条件下沿眼球赤道部剪开眼球全层，保留眼后节组织，用显微剪剪取视网膜神经纤维层，室温条件下用2%胰蛋白酶消化并轻轻吹打视网膜30min，除去较大血管后将残留的视网膜剪碎、匀浆，用孔径为100μm的尼龙滤网过滤，加入Ⅱ型胶原酶（0.066%）消化30 min，用DMEM培养液（含20%胎牛血清）终止消化，将细胞收集到离心管中，平衡后，每分钟1500 转，离心10min，向离心管内加1ml胎牛血清后收集细胞，将其接种于75cm2已涂纤维连接蛋白的培养瓶内，将细胞置于37℃的5%CO2培养箱内培养。为了洗去视网膜崩解及死亡的细胞碎片，两天换液一次，每次换液1/3，当细胞连接成单层细胞层，可进行传代。
2.2 人视网膜微血管内皮细胞的传代
2.2.1当人视网膜微血管内皮细胞间连接紧密，铺满培养瓶底80％以上时，可按1:2传代。
2.2.2 用吸管轻轻吸去培养基，加入3mlPBS液，轻轻晃动，清洗瓶底后吸去PBS液，共3次，加入1.5ml 0.25％胰蛋白酶溶液，轻轻晃动培养瓶后将其置于37℃消化3min后，取出置于镜下观察，当出现细胞呈圆形，细胞之间间隙变大，细胞质回缩时，加2ml培养液中止消化，用吹打管吸取培养液后吹打贴满细胞的培养瓶壁，为避免损伤内皮细胞，吹打时动作要轻柔，反复吹打直到大部分细胞从瓶壁上脱落。
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2.2.3 吹打后的内皮细胞悬浮液，按比例1：2接种到无菌新的培养瓶中，再滴加2ml培养液，显微镜下观察后将其置于37℃的5%CO2培养箱中培养。
2.3 人视网膜微血管内皮细胞的鉴定
将无菌盖玻片置于6孔培养板内，在超净工作台内用紫外线灯照射3小时。实验采用对数生长期长势良好的第4代细胞，将细胞用0.25%胰蛋白酶消化成细胞悬液后细胞计数，调整细胞密度为6×104个/ ml，在培养板每孔与盖玻片之间滴上一滴培养基，将细胞悬液接种到盖玻片上，每个孔接种2ml，接种完后将6孔板置于37℃的5%CO2培养箱中培养。培养48小时后可见盖玻片上爬满细胞，此时用吸管轻轻吸去培养液，加2mlPBS液洗涤3次，向各孔加入无水乙醇（90%）脱水固定30min，加入PBS液洗涤3次，5min/次；为了封闭内源性过氧化物酶，用过氧化氢-甲醇(3%)室温下浸泡30min；加入PBS液漂洗细胞3次，5 min/次，再将其置于非免疫兔血清湿盒内封闭30min，弃去多余血清后甩干；加入工作浓度为1:200的兔抗鼠Ⅷ因子抗体（一抗）后，将其置于4℃冰箱过夜，用PBS液洗涤3次，3min/次；滴加二抗，置于37℃孵育30min，加PBS液洗涤3次，3min/次，加入链酶亲和素一生物素—过氧化物酶复合物（SABC染色法），置于37℃孵育20min，加PBS液冲洗3次，5min/次，用DAB显色6min，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，用浓度分别为75％，85％，100％的梯度酒精依次脱水，二甲苯透明，最后用中性树脂封片。阴性对照用PBS缓冲液替代兔抗鼠Ⅷ因子抗体。
3、药物浓度及实验分组
丙丁酚的浓度分为5µmol/L，10µmol/L，20µmol/L， 40µmol/L，80µmol/L四组。实验分组：0组（调零组）：只加培养基不加细胞；G0组：高糖对照组；GL组：低糖对照组；G1组：高糖+ 5µmol/LPBC组；G2组：高糖+10µmol/L PBC组；G3组：高糖+20µmol/L PBC组；G4组：高糖+40µmol/LPBC组；G5：高糖+80µmol/LPBC组。低糖组中葡萄糖的浓度为5.5mmol/L，各个高糖组中葡萄糖的浓度均为25mmol/L。
4、MTT比色法检测不同浓度丙丁酚对HRCECs增殖的影响
实验采用处于对数生长期的第4代HRCECs，用吸管吸去培养基，加入PBS液洗涤3次，加入1.5ml胰蛋白酶（0.25%）消化，分别加含10%胎牛血清的高糖、低糖培养液，终止消化后进行吹打，制成高糖、低糖细胞悬液，进行细胞计数后将细胞浓
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度调整为6×104个/ml，将细胞悬液分别加入96孔板中，每孔180μL，依次为只加培养基的调零组（0），低糖对照组（GL），高糖组（G0～G5），每组重复6个复孔，周围空出2排孔加PBS液缓冲。将96孔板置于37℃CO2培养箱内培养24h，可见各孔细胞贴壁，向G1～G5组分别加入不同浓度PBC20μL，DMSO的最终浓度低于0.1%，加药组PBC的终浓度分别为为5µmol/L，10µmol/L，20µmol/L， 40µmol/L，80µmol/L。加药后继续置于37℃CO2培养箱内培养20小时后，在超净工作台内避光条件下每孔加入20μL 5g/L的MTT溶液，置于37℃CO2培养箱内继续培养4h后弃培养基，用滤纸吸干水分，终止培养，每孔加入DMSO原液150μL，室温下在摇床上低速摇振10min，待甲瓒（呈蓝紫色结晶）完全溶解后，将96孔板置于自动酶标仪上测每孔的吸光度A值，波长设置为570nm。以上条件下实验重复3次。按照公式计算：内皮细胞增生抑制率= [1-(试验组吸光度A值-调零组吸光度A值)/(对照组吸光度A值-调零组吸光度A值)]×100%。
5、免疫细胞化学检测不同浓度丙丁酚对HRCECs中VEGF表达的影
响
5.1将无菌盖玻片置于6孔培养板内，在超净工作台内用紫外线灯照射3小时。实验采用处于对数生长期长势良好的第4代细胞，加入1.5ml胰蛋白酶（0.25%）消化，分别加含10%胎牛血清的高糖、低糖培养液，终止消化后进行吹打，制成高糖、低糖细胞悬液，进行细胞计数后将细胞浓度调整为6×104个/ml，在培养板每孔与盖玻片之间滴上一滴培养基，将细胞悬液接种到盖玻片上，每组重复2孔，每个孔接种1.8ml，依次为低糖对照组（GL），高糖组（GO、G1、G4、G5），接种完后将6孔板置于37℃的5%CO2培养箱中培养24小时，可见盖玻片上爬满细胞，向G1、G4、G5组分别加入不同浓度PBC0.2mL，DMSO的最终浓度低于0.1%，加药组PBC的终浓度分别为为5µmol/L，40µmol/L，80µmol/L。加药后继续置于37℃CO2培养箱内培养24h后，吸去培养液，加PBS液洗涤3次，向各孔加入无水酒精（90%）脱水固定30min，加PBS液洗涤3次，5min/次；为了封闭内源性过氧化物酶，用过氧化氢-甲醇(3%)室温下浸泡30min；加入PBS液洗涤细胞3次，5 min/次，再将其置于非免疫兔血清湿盒内封闭30min，弃去多余血清后甩干；一个复孔滴加兔抗人VEGF-IgG（一抗），另一复孔滴加PBS液，置于4℃冰箱内过夜后，取出加入PBS液洗涤3次，3min/次；滴加二抗，置于37℃恒温箱30min，加PBS液洗涤3次，3min/次，加入链酶亲和素
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一生物素—过氧化物酶复合物（SABC染色法），置于37℃孵育20min，加PBS液冲洗3次，5min/次，加入DAB显色6min，置于自来水中冲洗中止显色反应，苏木素染色后，用浓度分别为75％，85％，100％的梯度酒精依次脱水，二甲苯透明，最后用中性树酯封片，显微镜下摄片观察。以上实验重复4次。阴性对照中的一抗用PBS液替代，阳性染色细胞浆内可见棕黄色颗粒着染。
5.2 图像分析：采用来自北京华威中仪科技有限公司的细胞图像分析系统测定各组细胞的灰度值，镜下随机测量100个阳性细胞的灰度值，取平均值，灰度值的大小与细胞阳性颗粒的表达成正比。各组灰度值计算公式为：每组灰度值=阳性灰度值—背景灰度值。
6、统计学分析
采用SPSS17.0软件对所有实验结果进行统计学分析，各组的实验数据以均数±标准差表示（xs），组与组之间均数差异的显著性用SNK-q检验，多组间均数差异的显著性检验用单因素方差分析，检验水准为α＝0.05。
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结 果
1、人视网膜血管内皮细胞原代培养和鉴定
1.1 实验采用了具有高度选择性的培养基对人视网膜微血管内皮细胞进行培养，细胞以较快速度生长，刚培养的内皮细胞液中含有大量内皮细胞及胶质细胞、红细胞、周细胞等杂细胞，2d换一次培养基，第2d在倒置相差显微镜下观察细胞形态可见贴壁的内皮细胞呈竹叶形状，5d后可见细胞聚集成簇，杂细胞逐渐除去，第10d可见细胞呈铺路石样铺满培养瓶底80%，以1∶2进行传代培养，细胞生长较快, 每3d可传代一次，多次传代后细胞老化呈长梭形。
1.2 运用免疫细胞化学方法鉴定HRCECs：HRCECs经过第Ⅷ因子相关抗原抗体染色后细胞浆中可见棕黄色颗粒染色，着色的阳性细胞占95.2%，阴性对照组无染色，证明已成功于体外培养出内皮细胞。（见图1，2，3）
图1 原代培养的视网膜血管内皮细 图2 原代培养的视网膜血管内皮细胞胞2d，可见大量杂质 ×200 8d，融合成单层犹如铺路石样 ×200
图3 原代培养的视网膜血管内皮细胞 Ⅷ因子相关抗原抗体染色阳性 DAB×200
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2、MTT比色法检测PBC对HRCECs增殖的影响
长势良好处于对数生长期的HRCECs经过不同浓度的PBC作用24h后，MTT检测显示调零组、GL组、G0～G5组吸光度A值分别为0.1015±0.0094，0.8172±0.0116，0.9317±0.0123，0.8628±0.0111，0.7608±0.0103，0.6455±0.0221，0.5600±0.0109，0.4775±0.0106。G1～G5各组细胞抑制率分别为8.40%，20.84%，34.90%，45.32%，55.38%。同一作用时间下，高糖对照组吸光度A值明显高于低糖对照组，两者相比差异有明显统计学意义（P<0.05）。与高糖对照组相比加药组吸光度A值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，并且加药组各组之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。加药组对HRCECs的增殖有明显抑制作用,并存在浓度的依赖性，随着药物浓度的逐渐提高,细胞存活率逐渐下降，而细胞抑制率逐渐升高。（见表1，图4）。
表1 Probucal对HRCECs增殖的影响(xs，n =6)
组别 0 GL G0 G1 G2 G3 G4 G5
A570 值 0.1015±0.0094 0.8172±0.0116 0.9317±0.0123c 0.8628±0.0111a,b 0.7608±0.0103a,b 0.6455±0.0221a,b 0.5600±0.0109a,b 0.4775±0.0106a,b
抑制率 (%) / / / 8.40 20.84 34.90 45.32 55.38
acb
附注： P <0.05 vs G0 组； G0 vs GL组：P<0.05；G1～G5各组间两两比较：P < 0.05 (One-way ANOVA, q test)
16
图4 不同浓度PBC对HRCECs增殖的影响
17
3、免疫细胞化学检测PBC对HRCECs中VEGF表达的影响
视网膜血管内皮细胞中VEGF主要在细胞浆中表达，阳性染色为棕黄色颗粒。对照组及各加药组灰度值测定结果分别为：28.75±3.77，71.93±8.37，54.67±4.33，41.43±3.45，29.18±3.37。与高糖对照组相比，加药组作用24hVEGF表达明显下降（P<0.05），且呈药物浓度依赖性，胞浆内阳性颗粒随着药物作用浓度的增加而减少，颜色逐渐变淡，加药组各组之间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。与低糖对照组相比，高糖对照组VEGF的表达明显增加（P<0.05），胞膜及胞浆内阳性颗粒较密集，颜色较深（见表2，图5，6，7，8，9，10，11）。
表2 Probucal对HRCECsVEGF表达的影响(xs，n =4)
组别
低糖对照组 高糖对照组
高糖+5µmol/L 高糖+40µmol/L 高糖+80µmol/L
VEGF灰度值
28.75±3.77 71.93±8.37c 54.67±4.33 a,b 41.43±3.45a,b 29.18±3.37a,b
附注：cP <0.05 vs 低糖对照组；aP <0.05 vs 高糖对照；各加药组间两两比较：bP<0.05
18
图5 不同浓度PBC对HRCECs中VEGF表达的影响
附注： P <0.05 vs GL组；G0、G1、G4、G5各组间两两比较：*P <0.05
△
图6 不同浓度PBC对HRCECs中VEGF表达的影响
19
图7：GL组 低糖对照组 图8：G0组 高糖对照组
SABC法×400 SABC法×400
图9：G1组 高糖+PBC 5µmol/L 图10：G4组 高糖+PBC 40µmol/L
SABC法×400 SABC法×400
图11：G5组 高糖+PBC 80µmol/L
SABC法×400
20
讨 论
视网膜激光光凝术和玻璃体切割手术是目前临床常用来降低DR致盲率的主要手段，这些治疗手段具有一定的损伤性，必要的视网膜激光光凝术在治疗的过程中也会在一定程度上损害患者视野、视力以及暗适应[10]，给患者带来不同程度的痛苦及并发症且不能改善和提高患者的视觉质量。目前多种抗血管新生药物的出现为DR的治疗带来了新的希望。抗血管新生因子（VEGF）及其受体药物的研制已成为当前热门的研究领域。目前临床应用的抗VEGF药物主要为：兰尼单抗、阿瓦斯汀、哌加他尼钠等，给药方式为玻璃体腔内注射，这些药物价格昂贵，且其可引起眼内炎、失明等严重副作用已有相关报道。因此全身给药的抗新生血管药物研究具有重要意义。
1、视网膜新生血管和VEGF
视网膜新生血管形成是视网膜静脉周围炎、糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞等缺血性致盲眼部疾病共同的病理过程。因此，了解并及防治视网膜新生血管的形成显得尤为重要。新生血管的形成与低氧分压、静脉引流及存活视网膜状态等因素相关。目前研究表明：视网膜新生血管形成过程较为复杂, 依次出现视网膜血管扩张使其通透性增加，然后血管基底膜经血管壁基底膜酶降解后，血管内皮细胞发生迁移、趋化、有丝分裂，形成血管腔，平滑肌细胞、周细胞及大量细胞因子参与等多个步骤有序协调的完成[11]，最终形成新生血管网。病理条件下新生毛细血管结构不健全，是一种不健康的血管，常引起视网膜大量出血与玻璃体大量积血，纤维增殖膜形成，导致牵引性视网膜脱离、黄斑水肿，患者视力功能严重受损。参与视网膜新生血管形成的细胞因子包括血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子( bFGF) 、血小板衍生生长因子( PDGF)、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子、胰岛素生长因子、基质金属蛋白酶（MMP）、色素上皮衍生因子(PEDF)、缺氧诱导因子（HIF-1）、肝细胞生长因子( HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)等, 而VEGF被认为是最重要的血管生长因子[12]。在DR的发病机制中，持续的慢性高血糖作用下，氧化产生大量的糖基化终末产物，使血管内皮细胞受损伤、细胞因子及细胞黏附分子活化（特别是VEGF的高度表达）、微血栓形成、白细胞停滞 [13]。
人类VEGF基因总长28kb，位于第6号染色体的p12～p21处，包括7个内含子、8
21
个外显子，同源二聚体糖蛋白是其编码的产物，具有较强促进血管内皮分裂的作用，分子量在46000～48000之间。VEGF家族属于VEGF/PDGF超家族，包含PIGF，VEGF-D，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-A，VEGF-E，和蛇毒来源的VEGFs例如T.f.(Trimeresurus flavoviridis)svVEGF等7个家族成员 [14 ,15]。哺乳动物表达除VEGF-E和svVEGF以外的所有VEGF家族成员。目前已证实VEGF是内皮细胞选择性有丝分裂原，除能增加内皮细胞胞浆内Ca2+的浓度及使微血管(主要是毛细血管后静脉及小静脉)对大分子物质的通透性增高外，尚能从多种途径使内皮细胞形态呈细长状并刺激其复制，刺激葡萄糖转运入内皮细胞，促使内皮细胞、鼠单核细胞和胎牛成骨细胞移位，能改变内皮细胞基因激活的模式，上调纤维蛋白溶解酶原激活剂(包括尿激酶型及组织型)及其抑制剂PAI-1的表达，诱导其他内皮细胞蛋白酶，间质胶原酶和组织因子的表达[16]。VEGF家族的受体包括：神经纤维网蛋白-1（neuropilin-1，NRP-1），神经纤维网蛋白-2（neuropilin-1，NRP-2），VEGFR-l (Flt-1)，VEGFR-2 (KDR/Flk-1)，VEGFR-3(Flt-4)等[17,18]。VEGFR-2是VEGF-A介导内皮细胞发生增殖、迁移等多种病理生理功能的主要受体，VEGF-A能够与VEGFR-l(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1) 特异性结合，发挥其在内皮细胞的分化、血管管腔及新生血管的形成过程中的关键的作用 [19]。目前认为高糖、细胞组织受损、缺血缺氧等产生的氧化应激反应是促使内皮细胞分泌VEGF增加的主要原因。正常情况下，VEGF在眼内表达相对较弱，在有糖尿病视网膜病变，即使在单纯期，VEGF在眼内表达也是增加的[20,21]，并随病程延长及眼部病情加重而增高[20]。由此可见VEGF在糖尿病视网膜病变发展中，尤其在新生血管形成中是与其关系极为密切的一个因子[22]，VEGF不仅参与了新生血管的整个过程，还参与了DR病变的整个过程[23]。
VEGF参与DR的发生机制为：(1) VEGF可以激活内皮细胞某些基因，通过上调血浆纤溶酶原激活物等的表达，使细胞外基质变性，提高血管的通透性，促进内皮细胞的迁移和新生血管的形成[24]。(2)邻近细胞分泌的VEGF通过旁分泌作用于内皮细胞，从而促进其趋化、迁移、增殖、形成新生血管。(3)通过多种途径提高内皮细胞对葡萄糖的摄取能力，从而增加葡萄糖在细胞内的水平。(4)VEGF可增加细胞表达ICAM-1，刺激白细胞释放多种细胞介质，破坏血管壁正常结构和功能，使血小板聚集，血流速度缓慢，形成微血栓，加重视网膜缺血缺氧，最终形成新生血管。
2、丙丁酚的药理作用和临床应用
22
2.1 调脂作用
丙丁酚具有明显的调节血脂的作用，主要降低血清胆固醇。多项动物和临床实验结果都表明，丙丁酚能显著降低血浆总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，促进胆固醇逆转运。其作用机制如下：（1）抑制胆固醇的生物合成。Michihara 等[ 25]研究发现，服用丙丁酚后的小鼠与正常对照组相比，总胆固醇、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase) 的量和活性以及甲羟戊酸-焦磷酸脱羧酶(Mevalonate pyrophosphate decarboxylase, MPD)的量和活性均有所下降。（2）增加肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDL-R)的数量及活性，或通过非受体机制加速LDL-C代谢分解[26]。（3）增加胆固醇脂转移蛋白及载脂蛋白E(ApoE)的表达，抑制载脂蛋白AI的合成，增强胆固醇逆转运功能（4）上调腺苷三磷酸结合盒转运体AI(ABCA1)蛋白的表达，减少细胞脂质释放[27]。
2.2 抗氧化作用
人体内存在氧化和抗氧化系统，当人体出现病理现象如衰老、突变、肿瘤、炎症、缺血再灌注损伤，动脉粥样硬化时体内氧自由基产生增多，导致细胞膜结构、组织器官功能损害。经过Iqbal等人[ 28 ]的研究发现，丙丁酚能很好地抑制LDL、HDL及微粒体膜脂质的氧化损伤，并能抑制烟酰胺辅酶氧化酶的活性，结合氧离子，清除氧自由基[29]。丙丁酚可升高屏氧酶1（PON1）血清水平和肝细胞高屏氧酶1（PON1）mRNA的表达，从而增强HDL的抗氧化能力[30]。
2.3 抗炎作用
丙丁酚能减少巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)，白介素-1(Inter-leukin-1, IL-1)，高敏感C反应蛋白(high sensitivity-C-reactive protein, hs-CRP)，抑制粘附分子的表达[31]，同时能降低病变部位巨噬细胞沉积而发挥抗炎作用[32]，抑制动脉粥样硬化发生，与抑制病变部位脂质过氧化物沉积作用无关。
2.4 改善内皮功能
丙丁酚改善内皮功能机制如下：（1）减少血浆中血管细胞黏附分子1(VCAM-1)、细胞间黏附分子1( ICAM-1)、P选择素(P-selectin)等黏附分子表达，抑制内皮细胞增生、移行[33, 34]。（2）增加一氧化氮(NO)，舒张血管，抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和血小板粘附，以改善内皮依赖性舒血管作用[35]；（3）减少ox-LDL 形成，从
23
而抑制纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)分泌，增加组织型纤溶酶原激活物(tPA)分泌，维持二者之间的平衡，减少组织因子(TF)的表达，降低可溶性血栓调节素(sTM)浓度
[36]
，预防血栓形成。
2.5 抑制内膜增生和血管重构
氧化应激损伤VSMC，使其异常迁移、增殖、分泌大量细胞外基质，导致内膜增生狭窄。丙丁酚可抑制血管损伤时氧自由基的产生，减轻氧自由基对血管壁的损伤作用及对平滑肌细胞增殖的刺激作用，抑制新内膜增生，发挥其预防再狭窄的作用[37]。Tanous等[38]实验发现，丙丁酚通过促进内膜重建,能够有效地抑制支架内的血栓形成。另有研究[39]发现新西兰兔髂动脉经皮腔内冠状动脉成形术后应用普罗布考可显著抑制胰岛素样生长因子-I受体和血管内皮生长因子的产生。
2.6 抗动脉粥样硬化及保护心功能
丙丁酚具有降低胆固醇水平，稳定动脉粥样硬化斑块的作用。研究表明，丙丁酚能减少动脉粥样硬化患者心绞痛发作次数，改善心绞痛症状，改善心肌重构，降低急性心肌梗死的死亡率。
2.7 丙丁酚防治糖尿病及并发症
丙丁酚和胰岛素联合治疗糖尿病，可显著提高疗效减少并发症的发生。在Endo等[40]进行的开放的有白蛋白尿的2型糖尿病临床实验中发现，丙丁酚能有效降低尿蛋白排出，降低血清肌酸水平。在进展期，实验组患者血液透析自由率明显高于对照组，提示丙丁酚能阻断糖尿病肾病的发展，为发病率日益升高的糖尿病提供新的治疗途径。
2.8 抗肿瘤
动物试验发现，丙丁酚通过调整Fe-NTA对毒素和肿瘤的促进作用，降低肿瘤的发生率，能成为降脂、抗AS及预防氧化剂诱导产生的组织损伤和致癌作用的有效药物[41]。
2.9 保护神经系统
丙丁酚和小剂量西洛他唑联合治疗局部脑缺血具有协同作用， 而单一治疗作用不明显[42]，说明二者联合给药对神经系统具有潜在保护作用。随着对丙丁酚不断地深入研究，其提高机体免疫力、治疗不孕症等功能逐渐显现。
24
3、丙丁酚对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF表达的影响
已有大量文献报道证实PBC有降血脂、抗氧化、抗炎、改善内皮功能、抑制内膜增生和血管重构、神经和肾功能保护等作用，并已有研究证明PBC有防治糖尿病及糖尿病视网膜病变发展的作用，但对体外培养的HRCECs是否有影响？MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成量与细胞数成正比。此方法已应用于检测生物活性因子的活性、筛选大规模的抗肿瘤药物、测定肿瘤放射敏感性及细胞毒性实验等。本实验利用MTT比色法检测PBC对体外培养的高糖环境下的HRCECs增殖是否有影响。前期预实验结果显示当PBC浓度低于5µmol/L时，对细胞的增值无明显抑制效应，超过80µmol/L时对细胞的抑制作用无明显增强，且作用24h时抑制作用较强。因此我们采用了5µmol/L、10µmol/ L、20µmol/L、40µmol/L、80µmol/L的PBC处理高糖环境下的HRCECs，作用24h后发现，低糖对照组与高糖对照组相比有明显统计学意义（P<0.05），高糖对照组吸光度A值明显高于低糖对照组，这一结果符合高糖环境下早期（24h内）能明显刺激内皮细胞的增殖，晚期(大于48h)能促进其凋亡。加药组HRCECs吸光度A值明显降低，与高糖对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，并且加药组之间两两比较差异亦均有统计学意义(P<0.0 5)。PBC对高糖环境下HRCECs的增殖有明显抑制作用，并存在药物浓度的依赖性，随着药物浓度的逐渐提高，细胞存活率逐渐下降，而细胞抑制率逐渐升高。
实验采用了细胞免疫化学的方法检测分析不同浓度（5µmol/L、40µmol/L、80µmol/L）的PBC对高糖环境下HRCECs中VEGF表达的影响。免疫细胞化学的原理是依据抗原和抗体专一性结合，对细胞蛋白质、多肽及膜表面抗原等进行定位检测，包括免疫酶细胞化学技术、免疫铁细胞化学技术、免疫荧光细胞化学技术等，它是免疫学和细胞化学技术相结合而成的新技术。免疫细胞化学法检测结果显示：在24h作用时间下，与低糖对照组相比，高糖对照组VEGF的表达明显增加（P<0.05）。与高糖对照组相比，加药组HRCECs中VEGF表达明显下降，比较差异有统计学意义
25
（P<0.05），且呈浓度依赖性，随着PBC浓度的增加，VEGF表达量逐渐减少。大量研究已表明VEGF的大量表达能促进内皮细胞增殖、迁移，促进视网膜新生血管的形成，而VEGF表达的下调能减少内皮细胞的增殖，从而抑制视网膜新生血管的形成。因此，我们推测PBC抑制高糖下HRCECs的增殖可能是通过下调VEGF的表达而发生作用。但PBC下调VEGF表达的信号通路及具体作用调控点尚待进一步研究。
高糖对照组VEGF的表达明显较低糖对照组增加，此结果与高糖引起内皮细胞受损、缺氧从而促进内皮细胞VEGF表达的作用相符。PBC如何使高糖环境下HRCECs中VEGF表达下调？已有研究表明PBC能抑制冠状动脉血管内皮细胞VEGF的表达。我们分析认为PBC下调HRCECs中VEGF的表达与以下因素有关：（1）PBC能改善高糖下HRECEs缺氧状态是下调VEGF表达的主要原因之一，PBC具有抗氧化作用，能清除氧自由基，改善高糖环境下细胞的缺氧及氧化应激状态，从而下调细胞VEGF的表达。（2）PBC具有改善内皮的功能，能抑制细胞粘附分子的表达，减少细胞间粘附，增加一氧化氮，舒张血管，改善内皮依赖性舒血管作用，使病理状态下细胞的缺血缺氧状态改善，从而减少VEGF的分泌，抑制内皮细胞的增殖、迁移。（3）PBC通过影响细胞信号传导通路影响VEGF的表达，具体作用调控点尚待进一步研究。
问题和展望
本次实验通过MTT法证实了PBC能抑制高糖环境下HRCECs的增殖，通过免疫细胞化学证实PBC能下调高糖环境下HRCEC中VEGF的表达，人体DR的形成的病理生理变化是多种机制及多因素相互作用、影响、制约的结果，而本实验研究对象为体外培养的HRCECs，也只考虑了高糖这一单一的影响因素，且实验中不能排除高糖对HRCECs的渗透性损伤，其下调VEGF表达的具体机理是什么？需要以后在活体动物和基因水平上对PBC的药理作用机制进行更深入的研究。
PBC能抑制高糖下HRCECs的增殖并下调其VEGF的表达，这一药理作用在预防和治疗视网膜新生血管的形成、发展方面具有很好的发展前景，其治疗价值需要更广泛的基础和临床实验来确定。
26
结 论
1、PBC对高糖环境下HRCECs的增殖具有抑制作用，呈浓度依赖性； 2、PBC能下调高糖环境下HRCECs中VEGF的表达，呈浓度依赖性； 3、PBC可能通过下调VEGF的表达来抑制高糖环境下HRCECs的增殖。
27
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综 述
糖基化终产物与糖尿病视网膜病变研究新进展
摘要 综述高糖下蛋白质非酶糖化所产生的糖基化终产物(advanced glycation end
products, AGEs)对糖尿病视网膜病变发生发展过程的影响、生化机制，以及AGEs抑制剂在该病防治中的应用。
Abstract Summrize the biochemical mechanism，the application of inhibitor of AGEs
of Diabetic retinopathy, and the affect of AGEs on the development of Diabetic retinopathy .
关键词 糖基化终产物；糖尿病视网膜病变；抑制剂
Keywords advanced glycation end products; diabetic retinopathy; inhibitor
糖尿病（diabetes mellitus）是一种以血糖升高为特征的代谢性疾病。我国目前糖尿病患病率约5%，居世界第二位，并呈现低龄化趋势。糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy, DR）是糖尿病最常见的严重并发症，是糖尿病患者致盲的重要原因之一。糖尿病视网膜病变发生率在糖尿病发病5年后约为25 %，10年增至60%，15年后可高达80 %，其中危害最大的增殖性糖尿病视网膜病（PDR）变约占25 %。DR具有发病率高、致盲率高的特点，严重影响人类的生存质量，是当今医学领域的一大难题，受到国内外医学界的高度关注。
糖尿病视网膜病变(DR)是一种严重的致盲性眼病，其发病机制尚不确切。研究表明高糖血症是糖尿病最基本的病生理状态，高糖环境下能破坏血一视网膜屏障，启动和加剧糖尿病视网膜病变的进展[1]。临床研究表明：高血糖的严重程度和持续时间与糖尿病视网膜病变患病率与严重程度直接相关[2]。动物实验表明，高血糖能显著促进视网膜内皮细胞的迁移，从而促进新生血管的形成[3]。
人们在研究中发现，慢性高血糖引起机体蛋白质非酶糖化所形成的糖基化终产物(AGES)的大量堆积，是促进糖尿病视网膜病变发生及发展的主要途径之一。
糖尿病视网膜病是糖尿病最常见、最严重的一种慢性并发症。早期改变以周细胞选择性的丢失、内皮细胞增殖、基底膜增厚、血-视网膜屏障破坏、毛细血管瘤样增生等表现为特征。后期则以新生毛细血管和纤维化为特征。最终出现视网膜脱离、
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视力丧失。糖尿病视网膜病变的病理改变主要是由于长期高血糖导致视网膜微血管病变及由此产生的一系列眼内并发症。主要表现：①早期发生的毛细血管闭塞,后逐渐累积小动脉，其闭塞的主要原因可能是在长期高血糖情况下，山梨醇积聚于血管内皮细胞内，引起内皮细胞肿胀，导致微血管管腔狭窄，甚至闭塞。视网膜毛细血管床部分闭塞导致的视网膜内层缺血、缺氧，诱导各种细胞因子合成、释放，新生血管形成。②微血管瘤形成是局部视网膜组织缺氧所引起的一种内皮细胞增殖反应，属于视网膜血管最早期的结构变化，而微血管瘤形成的机理可能与血管壁周细胞变性有关。③微血管通透性增加，基底膜增厚。④周细胞的丢失减弱了对内皮细胞的接触性抑制作用，导致血管内皮细胞的增殖。⑤视网膜水肿、渗出、增厚，新生血管导致视网膜出血，玻璃体积血。⑥新生血管和纤维组织增生以及由于纤维血管膜或玻璃体后界膜收缩所引起的牵引性视网膜脱离。
1、糖尿病视网膜病变的发病机制
1.1 多元醇通路激活学说 长期高糖条件下，醛糖还原酶(aldose reductase ，AR)
活性增加，细胞内山梨醇堆积，引起细胞的渗透性肿胀。肌醇代谢异常，使周细胞Na-K-ATP酶活性降低，导致周细胞死亡。同时血管内皮细胞受损，出现无结构的微血管，最后血管闭塞，视网膜缺血缺氧，导致新生血管形成。此外, 醛糖还原酶的激活引起内皮源性一氧化氮(NO)合成减少，使内皮依赖性血管舒张功能受损[4] 。
1.2 甘油二脂一蛋白激酶(DG- PKC)系统学说 高血糖可提高组织内DG 的含
量，继而激活了PKC的活性。PKC可促进多种细胞因子的表达, 如血管内皮生长因子(VEGF) 、PDGF 等, 促进新生血管的形成； 可使诱导型NO生成增加，损伤内皮细胞和周细胞；PKC还可抑制Na+-K+-ATP酶的活性。高血糖诱导的PKC活性增强的作用还表现在调节多种蛋白质的基因表达以及影响微血管细胞中的生化代谢。
1.3 生长因子学说 大量证据表明,长期高血糖条件下，视网膜缺血、缺氧刺激各种
生长因子的合成、释放，目前已经发现了数十种细胞因子，包括胰岛素生长因子(IGF)，肝细胞生长因子（HGF），血小板衍生的生长因子（PDGF），碱性成纤维生长因子（bFGF），基质金属蛋白酶(MMP), 肿瘤坏死因子（TNF），表皮生长因子（EGF），血管内皮生长因子（VEGF），色素上皮衍生因子(PEDF)与缺氧诱导因子(HIF-1)等。正常生理情况下血管内皮细胞所处微环境中的促血管生成因子和抗血管生成因子处于动态
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平衡。当促血管生成因子处于优势时，则血管新生过程启动，形成新生血管；当抗血管生成因子处于势时，血管处于静止状态,甚至退化。研究发现[5]， 阻断VEGF受体信号传导通路抑制视网膜新生血管形成，表明VEGF在新生血管形成中起到关键作用。Tolentino[6]等在正常动物眼内注射VEGF可诱导糖尿病样视网膜病变，表明VEGF参与DR的早期病变。
1.4 自由基学说 自由基使膜通透性增强，自由基通过攻击膜蛋白及胞内的酶系统
和核酸，使细胞增殖周期延长，并可诱导细胞凋亡。DR时，视网膜内自由基增加，脂质过氧化物(LPO)、丙二醛(MDA)增高，超氧化物歧化酶(SOD)减少。研究表明SOD对氧化应激环境中的内皮细胞及周细胞有保护作用[7]，而LPO及MDA则在糖尿病慢性并发症中起着重要作用[8] 。
1.5 糖基化终产物学说(advanced ycation end products, AGEs) 慢性高血糖可导致
组织大分子的非酶促糖基化增多。视网膜中的AGE增多导致内皮细胞功能紊乱；改变血管结构与功能，干扰NO的作用，使血管的舒张功能受损；抑制周细胞的增殖，促进内皮细胞的增殖，导致新生血管的形成。AGE还可诱导细胞因子的产生，激活蛋白激酶C（PKC），参与DR的形成。
2、AGEs
2.1 AGEs的形成及特性
AGEs是以蛋白质、脂肪及核酸的氨基和还原糖(葡萄糖、果糖、戊糖等)为原料，在生理环境中发生非酶催化反应，生成的稳定的共价化合物，该反应又称为Maillard反应。AGEs可以与其他蛋白质、核酸大分子物质以及脂类形成巨交联物，从而改变了一些重要蛋白分子的功能性特征。AGEs及其蛋白加成产物是很稳定且不可逆的。AGEs通过两种方式发挥作用：非受体途径(直接损伤)和受体途径[9]。直接损伤是通过对蛋白质的直接修饰，改变其结构功能；AGEs形成过程中的高活性中间产物是强的糖化剂，也可直接改变靶组织蛋白的功能。受体途径是AGEs可通过与细胞表面特异受体相互作用，产生多效性反应。目前认为后者是主要的。机体内AGEs受体种类较多，功能也较复杂，目前认为RAGE是介导AGEs对心血管系统损伤反应的主要受体，RAGE受体是一种含有多个配体的细胞表面蛋白，属于细胞表面分子免疫球蛋白超家族中的一员，RAGE由400多个氨基酸组成，分为3个区域，其
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胞外部分包含了1个V区和2个C区，氨基端的V区是与AGEs结合的主要部位。RAGE作为信号传导受体广泛存在于多种细胞表面，可以与AGEs结合形成AGE-RAGE，从而激活细胞内信号途径，启动细胞内一系列反应。单核巨噬细胞可以摄取AGEs、将其降解为AGEs多肽，单核细胞还可以通过分泌细胞因子激活细胞外溶蛋白系统。血浆中的AGEs通常以AGEs多肽的形式存在，降解形成的AGEs多肽正常情况下主要依靠肾脏清除[10]。
AGEs是指在非酶促条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等的游离氨基与葡萄糖或其它还原糖的醛基通过Maillard反应系列产生一组稳定的终末产物[11]。在经典的Maillard反应中，首先是游离氨基与糖分子中的醛基反应形成schiff碱，然后schiff碱上电荷与双键发生重排产生可逆的早期糖基化产物-amadori产物，后者经过脱水和缩合等复杂的反应,最后形成不可逆的晚期AGEs[12]。体内常见AGEs的分子结构类型是：羧甲基赖氨酸(CML)、戊糖苷素(pentosidine)[13]，除此之外还有羧乙基赖氨酸(CEL)、羧甲基缬氨酸(CMV)、精氨嘧啶(argpyrimidine)、吡咯素(pyrraline)、羧甲基鸟嘌呤(CEG)、果糖酰赖氨酸(fruc-tosyllysine)、咪唑酮( mi idazolone)等[14]。非酶糖基化反应形成的AGEs性质稳定，到目前为止，尚未发现能够使AGEs逆转的细胞系。
2.2 AGEs的作用机制
AGEs在体内引起DR病变的可能机制如下：(1)血管舒缩调节功能异常：内皮细胞分泌的一氧化氮(NO)即血管源性舒张因子，是一种重要的舒血管因子，同时还具有抗动脉粥样硬化形成、调节单核及中性粒细胞粘附等作用。高糖环境下，AGEs在血管壁的沉积和增多，可通过多种途径影响NO的合成代谢[15]，包括:引起内皮细胞NO的合成减少;通过与NO进行快速化学反应，使其灭活增加；与NO竞争结合其载体分子，使其丧失运载NO的能力；与NO有关的信号传导功能降低，从而显著影响NO介导的。
血管舒张功能，导致血管收缩、炎症反应和血栓形成，最终造成视网膜结构和功能损伤。(2)氧化应激作用增强:研究表明，长期的高血糖易使各种蛋白质发生糖基化，许多长寿蛋白质如胶原蛋白随着糖化作用延长而不断糖化，形成AGEs的同时不断产生氧自由基(OFR)或活性氧簇(re-active oxygen species，ROS)，并降低视网膜微血管细胞内过氧化酶的活性，增加脂质过氧化物MDA的含量，进一步引起微血
35
管损伤，如:产生硫代巴比妥酸反应性物质；产生血红素加氧酶mRNA；激活转录因子NF-κB。这3种征象是细胞氧化应激时的共同反应。氧化应激还能诱导血管生长因子VEGF的过度表达，促使新生血管形成，导致增生性糖尿病视网膜病变发生
[16]
。(3)细胞外基质(ECM)结构和功能异常：ECM的毛细血管基底膜(CBM)增厚和肥
大是糖尿病微血管病变的特征性表现[17]。AGEs可以诱导ECM中的长寿结构蛋白发生不可逆交联，如IV型胶原、层粘连蛋白及纤维连接蛋白等,并能降低基质蛋白对水解酶的敏感性从而减少降解[18]；AGEs作用于IV型胶原，不利于胶原网状结构形成;作用于I型胶原可使分子间空隙增大；AGEs使玻璃体连接蛋白与肝素的结合减少， 从而刺激血管壁中其它基质过度增生等。这些改变影响细胞的生长、聚集，迁移和粘附，从而进一步引发新生血管及纤维组织增殖，CBM增厚，出现浸漏，最终发展为纤维组织与玻璃体的粘连[19]。(4)与细胞膜上的受体结合，促进白细胞粘附、聚集和活化:高糖环境中，很多细胞的表面如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞都有AGEs特异性受体(RAGE)的表达。实验性糖尿病大鼠模型的视网膜中，包括视网膜限制性内膜层和网织内层以及视网膜血管的内皮、平滑肌和外膜细胞内，都可见AGEs与AGEs受体广泛存在。二者结合，可诱导氧化应激，激活NF-κB，刺激多种粘附分子基因过度表达，如E-选择素、P-选择素、VICAM-1和VCAM-1等[20,21]；同时AGEs还使内皮细胞分泌单核细胞趋化因子-1增加，诱导单核细胞的趋化，激活和迁徒。单核细胞激活后分泌低水平的IL-1、TNF-α、PDGF和C-反应蛋白等细胞因子和生长因子，从而引起慢性细胞活化作用和组织损伤，在DR中起着重要的作用[22,23]。(5)其它机制：AGEs促进VE(vascular endothelial)-钙粘蛋白降解。血-视网膜屏障功能依靠内皮细胞间形成的特异性的连接维持，包括紧密连接和粘附连接。钙粘蛋白是粘附连接的基本组成。其中VE-钙粘蛋白能介导钙依赖性的同种内皮细胞间的粘附[24]，并能调节内皮细胞的多种行为活性，如细胞活力、形成血管、对生长因子的应答反应、细胞存活等[25]。研究表明，AGEs能显著减少视网膜血管内皮细胞VE-钙粘蛋白的表达，由此伴随血管渗透性的增加。在糖尿病动物模型的离体微血管中，还能观察到VE-钙粘蛋白mRNA的下调[26]；AGEs可使胞浆[Ca2+]i水平显著增高。在传递细胞信息、调控多种细胞效应等方面有重要作用的[Ca2+]i的平衡失调，可触发细胞死亡机制，加速细胞磷脂的降解和细胞骨架的破坏，并导致细胞能量代射障碍，造成细胞的损害和死亡[27]。
36
3、糖尿病时AGES增多的原因
Monnier等[28]用DCCT(Diabetes Conuol and Complications Trial)病人的皮肤标本研究发现CML和病程中的平均HbAlc浓度相关，说明血糖是重要的影响因素，且是长期效应；研究还发现短期的血糖升高可使细胞内的3-脱氧葡萄糖醛酮的量增多，从而AG-1的合成也增多。氧化应激：氧化型AGES与血糖的相关性不如非氧化型AGEs明显，许多研究发现它与氧化应激如自由基、活性氧引起的老化关系更密切[29,30,31]，这点前文已有叙述。在糖尿病或其它严重的全身疾病时氧化应激势必增加，从而氧化型AGES也增多。消除能力减弱:糖尿病时游离的AGES大量增多，肾脏的负担加重，但糖尿病性肾病使得清除能力十分有限；当高血糖持续存在时AGEs的清除系统(如RAGE)不能胜任，使产生与清除的动态平衡破坏。与胶原等大分子交链的AGES，如存在于玻璃体、晶状体或血管壁间质中的AGES，则更不易被清除[32]。
AGEs可以引起视网膜微血管内皮细胞的损伤和炎症反应的发生。研究表明, AGEs通过与视网膜毛细血管周细胞特异性受体RAGE结合，激活N F- kB，从而降低其抗氧化物酶的活性，增加脂质过氧化物的含量[33]。而AGEs的增加可上调视网膜毛细血管周细胞RAGE的表达，促进RAGE与AGEs结合，相互作用触发细胞内下游信号转导，增加视网膜毛细血管周细胞的氧化性损伤，导致周细胞选择性丧失，引起糖尿病视网膜病变的发生、发展[34]。
晚期增殖型视网膜病变（PDR）以新生血管形成、视网膜内外出血为主要特征。在PDR患者房水或玻璃体腔中，促血管新生因子水平如VEGF、细胞因子、生长因子等显著升高[35,36,37]，其中VEGF可能起着最关键的作用[37]。于佩博士等人研究发现:在人脐静脉内皮细胞研究中发现，VEGF能够通过PI3K/AKT途径和MAPK/ERK途径促进脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和血管腔的形成[38,39,40]。研究表明ACES与特异性受体结合后引起活性氧中间产物的生成，而后者可促使VEGFrnRNA的表达
[41]
，从而使糖尿病视网膜玻璃璃体内VEGF升高。
VCAM-1主要介导单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞与内皮
细胞的粘附迁移，是血管内皮细胞表面重要的粘附分子[42]。正常情况下，内皮细胞表面粘附分子呈现低表达或不表达。糖尿病患者的内皮细胞RAGE表达增加。研究表明[43,44]，RAGE受体可激活NF-kB及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)
37
氧化酶，促进氧化应激反应，上调炎性因子(如血管细胞粘附分子-1、细胞间粘附分子-1、单核趋化因子-1)的释放，加速新生血管的形成。
4、AGEs抑制剂
(1)氨基胍：它与amadori反应阻止其进一步重排，从而抑制AGEs的形成。(2) RAGE抗体和重组可溶性RAGE(sRAGE)：是公认的RAGE阻断剂，抗RAGE抗体通过封闭细胞膜上的RAGE，使其不能与AGEs结合发挥生物效应。Yuichid等[45]研究发现，用sRAGE治疗含RAGE转基因的糖尿病小鼠，可以有效阻断RAGE-AGE的结合，并减少白细胞粘滞和血-视网膜屏障的破坏。（3）苯磷硫胺：是VitaB1的衍生物可以抑制AGEs和PKC及己糖胺途径的激活，抑制高血糖诱导的NF-kB的激活[46,47]。（4）肝素作为阴离子聚合体：能够封闭单核细胞表面的AGEs受体，以剂量依赖的方式抑制AGEs刺激下单核细胞分泌肿瘤坏死因子a ( TNF-a )、白介素-10(IL-10)，对AGES引起的病理改变具有潜在的治疗意义[48]，提示我们设法阻断AGEs产生的病理作用可能是一条新的治疗途径。
总结
AGEs是普遍存在的物质，高糖环境加速了它的形成，同时它又促进了组织的活性氧（ROS）和炎症，结果损伤了视网膜微血管导致视网膜病变。如何预防和治疗糖尿病视网膜病变极为重要。除控制饮食及血糖，眼部视网膜光凝术，经瞳孔温热疗法外，AGEs抑制剂及RAGE及VEGF拮抗剂的研究与应用具有重大的意义。
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[48] 任昊，候凡凡，张训. 肝素抑制晚期糖基化终产物诱导的单核细胞促炎症细胞
因子释放. 中华肾脏病杂志, 2001,17: 408-12.
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研究生学习期间发表的文章
1、李梅，彭辉灿. 糖基化终产物与糖尿病视网膜病变研究新进展. 西南军医杂志，2011；1（13）：1101-1102.
2、李梅，彭辉灿. 丙丁酚对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF表达的影响. 眼科新进展杂志，2011；3（31）：3228-3231.
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致 谢
感谢我的导师彭辉灿老师在我临床和科研工作中所给予的自始至终的悉心教导和谆谆教诲。他以严谨的治学态度、广博的理论知识和亲切的教学态度，指导我完成了三年的研究生学习，成为我今后工作、学习和生活的楷模。他所给与我的教诲和鼓励将使我受益终身。
感谢附二医院眼科中心何湘珍老师、李红老师、袁满红老师、宋江南老师、肖启国老师、费志刚老师、夏世刚老师、王智老师、刘翀、谭娟、罗洁老师等眼科全体老师及医护人员对我生活的关心，给予我课题研究和临床实践大力的支持和帮助。
感谢微生物教研室吴移谋教授、周洲博士等在实验中给予的的指导与关心。 感谢师兄罗贤令以及师弟师妹刘光辉、唐红，等在学习、工作方面给予的无私帮助和大力支持。
感谢我的同窗王春艳、苏杰、李曦、胡长波、王明良、汤雪娥、荷欢等在学习和生活中给予的帮助和支持。
感谢微生物教研室的研究生同学：李薇、黄志勇、陈列松、张君华、周安文等在实验和生活中给予的关心和帮助。
感谢南华大学和附二医院各级领导及老师给予的热切关怀。 感谢在百忙之中抽出时间对我的论文进行审阅和评议的专家们。
感谢我的亲人们，正是有了他们的理解和全力支持，我才能顺利完成我的学业。 谢谢大家！
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