——12生本 董
芳芳 12112314107
引言：果蔬是我们生活中很常见的食物，大多数果蔬中含有维生素
C、总糖、原还糖、蛋白质等多种有机物。这些成分对植物的生理活动起到很大的作用，同时也是我们人体所需的营养物质，不同种类的果蔬中这些成分的含量是不同的。本实验选取萝卜和盘菜作为研究对象，对其维生素C、总糖、原还糖、蛋白质含量及过氧化物酶活性进行分析，通过实验了解萝卜和盘菜在这些成分上含量的不同，并掌握滴定法、蒽酮比色法、考马斯亮兰法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法等实验方法。
1、实验材料：市售新鲜的萝卜和盘菜2、实验试剂和仪器
2,1果蔬中维生素C的含量测定
试剂：1%草酸溶液2%草酸溶液、维生素C标准溶液、氧化型0.1%2,6-二氯酚靛酚溶液
仪器：微量滴定管及架、台秤、50ml量筒、1ml及10ml吸管、100ml锥形
瓶、剪刀、滤纸
2.2果蔬中总糖及还原糖含量的测定
试剂：蒽酮试剂、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）、6ml/molHCI溶液、20%NaOH溶液
仪器：吸管1.0(×2) 5.0ml(×1) 0.1ml(×1) 0.2ml(×1) 0.5ml(×3)
试管1.5CM×15CM(×7)、分光光度计、水浴锅、电子分析天平、电炉、容量瓶（100ml×1）、玻璃漏斗、量筒、三角烧瓶、研钵
2.3果蔬中蛋白质含量
试剂：标准蛋白质溶液、考马斯亮兰G-250染料试剂0.05mol/LTris-HCl缓冲液
仪器:分光光度计、漩涡混合器、试管16支2.4果蔬中过氧化物酶分析试剂：
A(分离胶缓冲液)100ml
B(浓缩胶缓冲液)100ml
C(浓缩胶贮液)100ml
D(浓缩胶贮液)100ml
E核黄素100ml
F 蔗糖100ml
电极缓冲液100ml(用时稀释10倍)
封板胶（加热煮沸）仪器：垂直板电泳槽、直流稳压稳流电泳
仪、微量进样器、高速离心机、量样品提取液
筒、烧杯、玻璃棒、培养皿、分光染色液
光度计、研钵、恒温水浴锅、容量
前沿指示剂瓶、吸管
3、实验材料和方法
3.1果蔬中维生素C含量的测定
称取20..0g萝卜和盘菜芽放入研钵中研磨成匀浆后过滤，用少量2%草酸溶液洗涤，并稀释到一定体积吸取1ml维生素C标准溶液放入锥形瓶中，加9ml1%草酸溶液，摇匀，用染料液滴定至微红色保持15S不褪色即为终点，记下所用染料的体积，算出1ml染料相当于多少mg维生素C。吸取10.0ml样品液放入锥形瓶中，同上操作进行滴定，做两份求平均。
维生素C含量 m = ×100 = 每百克样品中含维生素C
毫克数
V×CW
m：每100克样品中含维生素C毫克数
V：滴定样品液所用去染料液（2，6-二氯酚靛酚）容积（mL）。
C：1mL染料液相当于维生素C的质量（mg/mL，由操作3计算得出）。
W：10mL样品稀释液中含有样品的质量数（g）。
3.2果蔬中总糖及还原糖的测定3.2.1葡萄糖标准曲线的制作
蒸馏水蒽酮试剂
01.04.0
10.10.94.0
20.20,84.0
30.30.74.0
40.40.64.0
50.50.54.0
标准葡萄糖溶液/ml0
置冰水浴中15min
煮沸10S,冷却后试问放置10S在620nm处比色
A620nm0.0000.1940.1650.4060.5670.719
取6支试管按上表配置溶液，并进行分光光度测定，以吸光度为纵坐标，
各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作标准曲线3.2.2样品中还原糖的提取和测定
分别称其1g萝卜和盘菜，在研钵中研磨成匀浆，转入锥形瓶中，并用约30ml蒸馏水洗涤研钵，洗涤液并入锥形瓶瓶中于50℃水浴中保温约0.5h(使还原糖浸出)，冷却后定容至100ml.过滤，吸取1ml滤液于试管中，置冰水浴5min,加入蒽酮试剂4.0ml于620nm处进行比色，在标准曲线上得出样品液中还原糖的含量
3.2.3样品中总糖的提取、水解和测定
分别称其1g萝卜和盘菜，在研钵中研磨成匀浆，转入锥形瓶中，并用约30ml蒸馏水洗涤研钵，洗涤液并入锥形瓶瓶中，向锥形瓶中加入6mol/L盐酸10ml，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h,冷却后用20%NaOH溶液中和至中性，再用蒸馏水定容至100ml，过滤，吸取1ml滤液于试管中，置冰水浴5min,加入蒽酮试剂4.0ml于620nm处进行比色，在标准曲线上得出样品液中还总糖的含量3.3果蔬中蛋白质含量的测定3.3.1蛋白质标准曲线的绘制 012345100ug/ml牛血清蛋白溶液/ml0蒸馏水/ml
0.20.40.60.81.01.00.80.60.40.20
考马斯亮蓝液/ml5.05.05.05.05.05.0
取6支试管配置上述溶液，摇匀后放置2min,在595nm下比色，以吸光度为纵坐标，各标准蛋白质含量（ug）为横坐标，绘制标准曲线
3.3.2样品的制备
分别称取1g萝卜和盘菜置于冰浴上的研钵内，加入1mlH2O研磨成
匀浆，转入离心管，用2ml水洗涤研钵并将洗涤液转入离心管，注意豆芽要在电子天平上用石英砂进行质量调平，3500rpm离心15-20min,离心后其上清液即为蛋白质提取液3.3.3样品测定
取上述提取液1.0ml，加入5.0ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置5min，在595nm下比色，记录数据，在标准曲线上得出对应蛋白质的浓度，再乘以稀释倍数，即为每克鲜果蔬中蛋白质的微克数3.4果蔬中过氧化物酶的分析3.4.1过氧化物酶同工酶的分离3.4.1.1安装电泳槽
安装好电泳槽后，用煮沸的琼脂封底，等琼脂凝固后，灌入刚配好的分离胶至短板侧2-3cm处为止，并用微量注射器注射入一约3mm的水层，带分离胶凝固后，用滤纸吸干覆 盖在分离胶上面的水层，灌入刚配置好的浓缩胶，插入梳子，带凝固后小心取出梳子，导入电极缓冲液并没过样品槽
3.4.1.2样品制备和点样
分别称取1g萝卜和盘菜置于冰浴上的研钵中研磨成匀浆，置于离心管中，研钵用少量提取液洗涤，洗涤液并入离心管中，以1400r/min的转速离心15min.用微量注射器分别吸取20ul、40ul、50ul在浓缩胶上层的槽中点样，点样完之后在丄槽液中滴加2-3滴溴酚蓝
3.4.1．3电泳和剥胶
接通电源后，把电流调至10mA，样品进入分离胶后加大到30mA,维持恒流。待指示染料下行到到距胶板末端1cm处即可停止电泳，关闭电源。取出胶板，去掉胶套用微量注射器向胶板中射入少量水后即可掀开胶板，用尺子测量蓝色带到分离胶顶部的距离，去掉浓缩胶，把剩下的分离胶小心放入培养皿中，想培养皿中倒入刚配好的染色液，并立即置于黑暗处染色，带染色后用尺子测量各酶带的距离，记录数据
3.4.2过氧化物酶活性测定
取3支比色皿，于一支加入1ml磷酸缓冲液和3ml反应混合液作为对照。另2支分别加入反应混合液3mml和萝卜
酶液1ml.立即开启秒表计时。于470nm处进行比色，每隔1min读数一次（连读5min,取平均值）
4、实验数据记录及结果计算
4.1果蔬中维生素C含量的测定4.1.1数据记录
待测液次数
123
平均消耗量(ml)材料重量（g）
萝卜1.301.301.45（舍去）
1.3020.0
盘菜1.151.051.101.1020.0
4.1.2结果计算
100g萝卜中维生素C的含量M=10.8mg100g盘菜中维生素C的含量M=12.8mg
4.2果蔬中总糖及还原糖含量测定4.2.1数据记录----葡萄糖标准曲线 01标准葡萄糖浓度(mg/ml)0吸光值
0.01
20.02
30.03
40.04
50.05
0.0000.1440.4210.4180.5500.683
样品
盘菜还原糖萝卜还原糖盘菜总糖萝卜总糖
0.33
吸光值0.460.270.614.2.2结果计算
1g盘菜中还原糖的质量分数W=0.34%
1g盘菜中总糖的质量分数W=0.405%1g萝卜中还原糖的质量分数W=0.2%1g萝卜中总糖的质量分数W=0.216%
4.3果蔬中蛋白质含量的测定
4.3.1数据记录-----------蛋白质标准曲线 012标准蛋白质含量/ug0吸光值
20
40
360
480
5100
0.0000.1350.2210.3370.3710.456
样品
对照盘菜盘菜
吸光值0.0000.4120.3644.3.2结果计算
每克盘菜中蛋白质含量=193.21ug每克萝卜中蛋白质含量=646ug
4.4果蔬中过氧化物酶分析
4.4.1数据记录------过氧化物酶同工酶分离
分离胶顶端到蓝带的距离L=7.2cm盘菜：
第一条同工酶的距离/cm2.1第二条同工酶的距离/cm
萝卜：
第一条同工酶的距离/cm第二条同工酶的距离/cm4.4.2结果计算盘菜：Rf1=0.292 Rf2=0.444萝卜：Rf1=0.278 Rf2=0.458
4.5过氧化物酶活性的测定4.5.1数据记录编号123对照组0盘菜萝卜
1.007
0
0
3.2
2.03.3
40
50
60
70
1.5261.6381.7001.7391.7851.821
-0.1360.0420.2280.3590.4480.5110.549
4.5.2结果计算
盘菜：过氧化物酶活力=272
过氧化物酶比活力=272萝卜：过氧化物酶活性=228 过氧化物酶比活力=228
5、讨论
5.1果蔬中维生素C含量的测定的讨论
向滴定管中装入染液时不应产生气泡，且操作过程要迅速，避免维生素C被氧化，滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。所测得的每100克样品中维生素c的含量与标准数值相比较低，可能原因是在滴定标准Vc时滴定终点没有判断好，导致读数过大。在滴定萝卜配液时，滴定终点也没有判断正确。
5.2果蔬中总糖及还原糖的测定的讨论
实验数据与标准数值比较较低，可能是定容时并没有将烧杯中残留的
萝卜，盘菜配液清洗干净。蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。溶液中的糖与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖含量成正比。注意在冰浴换江中滴加蒽酮避免发热影响颜色变化，总糖样品液在配置过程中是加过酸液的，所以需重新加碱调节pH值5.3果蔬中蛋白质含量的测定的讨论
如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，测定完后可用95%的乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
5.4果蔬中过氧化物酶分析的讨论
电泳槽的玻璃板一定要洗净吹干，接下来的封胶工作是很关键的，一定
要封严实，以免
灌胶时漏胶，如果这一步失败会浪费很多时间。在配置分离胶和浓缩胶时注意操作规范，
避免造成药品污染，以致不能凝胶。注射样品时要满满加以免样品扩散。染液要现配染色在黑暗环境下进行
6、总结
通过这次对盘菜，豆芽维生素C含量、总糖及还原糖含量、蛋白质含量、过氧化物酶的测定，熟悉了滴定法、比色法、电泳法等实验操作方法。同时了解了黄豆芽和绿豆芽所含的成分含量以及在这些成分含量上的区别。
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